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綜述|循環(huán)腫瘤細(xì)胞：從生物學(xué)新見解到臨床實踐

Circulating tumor cells: from new biological insights to clinical practice

癌癥患者高死亡率的主要原因是轉(zhuǎn)移，即腫瘤細(xì)胞通過血流從原始部位遷移到身體的其他部位。最近的技術(shù)進(jìn)步顯著增強(qiáng)了我們對循環(huán)腫瘤細(xì)胞 （CTC） 血源性擴(kuò)散機(jī)制的理解。DNA 甲基化是一個關(guān)鍵過程，調(diào)節(jié)基因表達(dá)和染色體穩(wěn)定性，從而維持體內(nèi)的動態(tài)平衡。整體低甲基化和基因座特異性高甲基化是 DNA 甲基化模式變化的例子，這些變化對致癌至關(guān)重要。

綜述首先概述了導(dǎo)致 CTC 形成的各種過程，包括上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化 （EMT）、免疫監(jiān)測和定植。然后深入分析了 CTC 中 DNA 甲基化的修飾如何影響 CTC 傳播過程中的每個關(guān)鍵階段。此外探討了 CTC 中 DNA 甲基化變化對癌癥患者的潛在臨床意義。通過了解這些表觀遺傳修飾，我們可以深入了解轉(zhuǎn)移過程，并確定用于早期檢測、預(yù)后和靶向治療的新生物標(biāo)志物。本綜述旨在彌合基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用之間的差距，強(qiáng)調(diào) DNA 甲基化在癌癥轉(zhuǎn)移背景下的重要性，并為改善患者預(yù)后提供新途徑。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞 （CTC） 是液體活檢的基本組成部分。CTC 的概念最初由 Ashworth 于 1969 年提出，可分為三類：上皮型、間充質(zhì)型和混合表型細(xì)胞。雖然大多數(shù) CTC 可以被宿主免疫系統(tǒng)消除，但一部分高度活躍和轉(zhuǎn)移性的 CTC 可能會逃避免疫清除，最終導(dǎo)致微觀癌癥病灶的建立、腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。因此，CTC 被認(rèn)為是個體致命轉(zhuǎn)移性疾病的合理來源。

CTC轉(zhuǎn)移的途徑、位置

a. 腫瘤細(xì)胞從原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性腫瘤中自然脫落，并在血液中循環(huán)。

b. 作為腫瘤轉(zhuǎn)移的“種子”，可能導(dǎo)致形成其他各種部位的轉(zhuǎn)移病灶。

為了成功從原發(fā)性腫瘤組織中分離，CTC 必須克服幾個障礙，包括：

1） 粘附：原發(fā)性腫瘤組織中的細(xì)胞外基質(zhì) （ECM） 和周圍細(xì)胞都被癌細(xì)胞牢牢粘附，癌細(xì)胞通常具有高度粘性。CTC 必須克服這些粘附力才能分離并進(jìn)入淋巴或血液系統(tǒng)。

2） 侵襲：癌細(xì)胞還必須能夠侵入鄰近組織才能到達(dá)淋巴管或血管。這需要細(xì)胞降解 ECM 和周圍組織。

3） 剪切應(yīng)力：一旦進(jìn)入血液或淋巴系統(tǒng)，CTC 就會由于液體的運(yùn)動而受到顯著的剪切應(yīng)力。這會對細(xì)胞造成機(jī)械損傷，還會引發(fā)細(xì)胞凋亡（細(xì)胞死亡）。

4） 免疫系統(tǒng)監(jiān)測：免疫系統(tǒng)不斷監(jiān)測血液和淋巴系統(tǒng)是否有外來或異常細(xì)胞。CTC 必須避免被免疫系統(tǒng)檢測到才能生存并可能形成繼發(fā)性腫瘤。

總體而言，CTC 分離和傳播的過程很復(fù)雜，涉及許多不同的因素。

分化的祖細(xì)胞或體細(xì)胞干細(xì)胞可能是具有腫瘤起始能力的癌癥干細(xì)胞 （CSC） 的來源。CSC亞群可能是導(dǎo)致復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的原因，CTC 研究的主要目標(biāo)是識別和消除這種循環(huán) CSC 群體。在識別和分離 CTC 中的 CSC 后，有可能更有效地對抗殘留癌癥。循環(huán) CSC 的起源可以考慮用兩種假設(shè)來闡明。一是癌性體細(xì)胞干細(xì)胞經(jīng) EMT 從主要腫瘤中排出進(jìn)入循環(huán)，這些細(xì)胞被稱為間充質(zhì) CSC。二是這些細(xì)胞可能是完全分化的癌細(xì)胞的結(jié)果，這些癌細(xì)胞經(jīng)歷了 EMT 途徑以獲得遷移特性。無論途徑如何，最終結(jié)果是 CSC 的擴(kuò)散，CSC 通過表現(xiàn)出間充質(zhì)、上皮和干性特征組合的中間細(xì)胞向生態(tài)位方向移動。這可以解釋在 CTC 內(nèi)的腫瘤起始細(xì)胞中觀察到的表面標(biāo)志物和/或轉(zhuǎn)錄因子的多樣性。CTC 的異質(zhì)性，源自 CSC 中的 EMT 或分化的癌細(xì)胞，強(qiáng)調(diào)了選擇識別重要標(biāo)志物的挑戰(zhàn)。

支持 CTC存活和早期轉(zhuǎn)移的 EMT 相關(guān)機(jī)制

a. CTC通過上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)機(jī)制釋放到血液中，包括單個細(xì)胞或集體遷移、內(nèi)滲以及被動過程，例如分離的腫瘤細(xì)胞或團(tuán)塊通過受損血管的分離。某些單個或成簇的 CTC能夠在血液中存活并在次級器官中形成轉(zhuǎn)移。這是由于它們具有在 EMT誘導(dǎo)的細(xì)胞中升高的特性，并有助于它們在血液中的存活和轉(zhuǎn)移的建立。

b. Fas/FasL信號通路在腫瘤發(fā)生中起著至關(guān)重要的作用，其中癌細(xì)胞損傷會導(dǎo)致對細(xì)胞凋亡的抵抗并導(dǎo)致腫瘤進(jìn)展和 CTC的產(chǎn)生，cEMT 進(jìn)展受整合素和 TGF-B等信號通路的調(diào)節(jié)，這些通路可以協(xié)同誘導(dǎo)下游反應(yīng)，促進(jìn) CTC存活和抗細(xì)胞凋亡特性。

CTC 簇生成的機(jī)制和潛在的 CTC 亞群在血液循環(huán)中存活

發(fā)生 EMT 的 CTC 會表達(dá)組織因子（TF），顯著促進(jìn)血小板活化。這些凝血依賴性機(jī)制啟動了腫瘤細(xì)胞周圍富含纖維蛋白/血小板的繭的形成，據(jù)信可以保護(hù)細(xì)胞免受剪切應(yīng)力、失巢凋亡和免疫攻擊。上述繭的形成對于 CTC 播種和早期建立至關(guān)重要。此外，已觀察到中性粒細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞和血小板發(fā)生物理相互作用，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活和增殖。此外，中性粒細(xì)胞有助于 CTC 粘附到血管壁上。中性粒細(xì)胞通過它們在中性粒細(xì)胞胞外陷阱 （NET） 中捕獲腫瘤細(xì)胞的能力——這些結(jié)構(gòu)也促進(jìn)凝血事件——有助于形成支持 CTC 存活的保護(hù)和錨定支架。這個過程有助于 CTC 在毛細(xì)血管中停滯和轉(zhuǎn)移形成的早期階段。上述凝血和中性粒細(xì)胞依賴性屏蔽機(jī)制可保護(hù) CTC 免受免疫破壞。此外，CTC，尤其是那些接受 EMT 的 CTC，具有更強(qiáng)的逃避免疫監(jiān)視的能力。促成這種情況的一種機(jī)制是免疫檢查點蛋白（如 PD-L1）的表達(dá)，這可能會增強(qiáng)它們對細(xì)胞毒性免疫細(xì)胞的抵抗力。在可能的休眠期后，CTC 最終可以恢復(fù)生長并引發(fā)繼發(fā)性腫瘤。

CTC與免疫系統(tǒng)監(jiān)測

CTC 克服免疫系統(tǒng)監(jiān)視的機(jī)制尚不完全清楚，但有幾種可能的方式可以逃避免疫系統(tǒng)的檢測。一種解釋是 CTC 抑制或掩蓋免疫細(xì)胞通常識別為異?；蛲鈦淼谋砻婵乖谋磉_(dá)。這會使 CTC對免疫系統(tǒng)的可見度降低，并使它們能夠逃避檢測。另一種可能性是 CTC 產(chǎn)生抑制或抑制免疫反應(yīng)的因子，例如將免疫細(xì)胞募集到腫瘤微環(huán)境中但隨后抑制其功能的細(xì)胞因子或趨化因子。例如，研究表明，CTC 可以產(chǎn)生細(xì)胞因子 TGF-β，它可以抑制 T 細(xì)胞和其他免疫細(xì)胞的活性。最后，CTC 可能能夠通過模擬正常細(xì)胞或使用其他機(jī)制來避免被發(fā)現(xiàn)來逃避免疫監(jiān)視。例如，一些 CTC 可能表達(dá)通常存在于健康細(xì)胞中的蛋白質(zhì)或分子，導(dǎo)致免疫系統(tǒng)難以將它們與健康細(xì)胞區(qū)分開來。

外周血中 CTC 的免疫逃逸機(jī)制

該圖描述了 CTC 用于規(guī)避免疫系統(tǒng)的各種機(jī)制以及 CTC 與外周血中免疫細(xì)胞之間發(fā)生的相互作用。循環(huán)腫瘤細(xì)胞 （CTC） 和自然殺傷 （NK） 細(xì)胞之間的相互作用是一個突出的研究領(lǐng)域，因為 CTC 分泌 LDH5 并通過 ADAM10 脫落 MICA/MICB 配體，從而抑制通過 NK 細(xì)胞介導(dǎo)的裂解識別和消除 CTC。該圖描繪了 CTC 采用的三種機(jī)制，以逃避 NK 細(xì)胞和 T 細(xì)胞通過 MHC I 分子的識別。這些策略包括通過與細(xì)胞表面結(jié)合的細(xì)胞角蛋白（CK8、CD18 和 CK19）掩蓋 TCR 對 MHC I 的識別，通過膜從血小板轉(zhuǎn)移到 CTC 獲得“偽正常”表型，以及減少或完全消除 MHC I 表達(dá)。CTC 與自然殺傷 （NK） 細(xì)胞之間的相互作用是一個重點領(lǐng)域，因為 ADAM10 從 CTC 中釋放 LDH5 和 MICA/MICB 配體會阻止它們通過 NK 細(xì)胞介導(dǎo)的裂解進(jìn)行識別和消除。此外，LDH5 增強(qiáng)循環(huán)單核細(xì)胞上的 NKG2D 配體表達(dá)，進(jìn)而降低 NK 細(xì)胞上的 NKG2D 表達(dá)。此外，該圖說明了 CTC 用于逃避免疫系統(tǒng)的其他策略，例如抑制性免疫檢查點分子 PD-L1 的上調(diào)、“別吃我”信號受體 CD47 的表達(dá)，以及凋亡蛋白 FAS 和/或 FASL 的表達(dá)改變。

表觀遺傳修飾在破譯 CTC 特性中的作用

表觀遺傳學(xué)涉及對基因表達(dá)的可遺傳改變的研究，這些改變發(fā)生在不對 DNA 序列本身進(jìn)行修飾的情況下。許多表觀遺傳修飾，包括組蛋白乙酰化和甲基化模式、microRNA 介導(dǎo)的基因調(diào)控、癌基因的低甲基化、腫瘤抑制基因的高甲基化等，極大地促進(jìn)了癌癥的進(jìn)展。

DNA 甲基化是甲基添加到 DNA 的胞嘧啶殘基上，對于調(diào)節(jié)基因表達(dá)至關(guān)重要。偏離正常或預(yù)期模式的 DNA 甲基化模式與各種健康狀況有關(guān)，包括癌癥。幾項研究表明，與原發(fā)性腫瘤相比，CTC 具有不同的 DNA 甲基化譜，這可能有助于檢測早期癌癥、預(yù)測癌癥預(yù)后和開發(fā)靶向治療。CTC 表現(xiàn)出與原發(fā)性腫瘤不同的獨特 DNA 甲基化模式。此外，CTC 的 DNA 甲基化模式也會受到治療的影響。 CTC 的基因甲基化景觀以及這些甲基化變化如何導(dǎo)致 CTC 介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移還需要進(jìn)一步的研究來揭示。此類研究可以揭示與轉(zhuǎn)移相關(guān)的腫瘤特異性表觀遺傳特征和腫瘤種群的異質(zhì)性。

跨癌癥類型 CTC 中不同基因的異常甲基化

在 CTC 中起作用的不同 DNA 甲基化修飾以促進(jìn)轉(zhuǎn)移

甲基化促進(jìn) CTC 分離和侵襲的過程是復(fù)雜的，涉及各種基因的高甲基化和低甲基化。上圖描述了不同類型甲基化改變對CTC轉(zhuǎn)移潛力的影響

a. 腫瘤抑制基因 （TSG） 和轉(zhuǎn)移相關(guān)基因 （MSG） 的高甲基化觸發(fā)了 CTC 的分離，并有助于增強(qiáng)其增殖能力。與單個 CTC 相比，CTC 簇表現(xiàn)出不同的 DNA 甲基化譜，其特點是 OCT4、NANOG、SOX2 和 SIN3A。

b. 等轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點低甲基化，這些轉(zhuǎn)錄因子是與干性相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，在誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 （iPSC） 的多能性網(wǎng)絡(luò)中起著至關(guān)重要的作用。

CTC 相關(guān)免疫中的 DNA 甲基化調(diào)節(jié)

DNA 甲基化在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用，包括樹突狀細(xì)胞發(fā)育和 T 細(xì)胞啟動和激活。

a 最近的研究揭示了染色質(zhì)重塑對腫瘤細(xì)胞中細(xì)胞毒性攻擊的反應(yīng)和腫瘤浸潤 CD8 T 細(xì)胞中耗竭表型的貢獻(xiàn)。

b CTLA-4 DNA 高甲基化與治療反應(yīng)不佳顯著相關(guān)，突出了 CTLA-4 甲基化作為治療結(jié)果預(yù)測生物標(biāo)志物的潛力。

c 在腫瘤細(xì)胞中，DNA 修飾會影響腫瘤抗原的產(chǎn)生、抗腫瘤細(xì)胞因子的沉默和 PD-L1 檢查點的誘導(dǎo)。

d 在 NK 細(xì)胞中，殺傷性 Ig 樣受體 （KIR） CpG 島的甲基化狀態(tài)對于維持克隆性 KIR 表達(dá)和調(diào)節(jié) NK 細(xì)胞識別和異常細(xì)胞裂解至關(guān)重要。

CTC甲基化模式的診斷及預(yù)后價值

對 CTC 中 DNA 甲基化模式的研究跨越多種癌癥類型，為它們作為診斷、預(yù)后和治療靶向的生物標(biāo)志物的潛力提供了見解。Madhavan 等人在研究 CTCDNA 作為轉(zhuǎn)移性乳腺癌預(yù)后診斷的潛力時，強(qiáng)調(diào)了循環(huán)游離 DNA 中甲基化模式作為腫瘤進(jìn)展和治療反應(yīng)標(biāo)志物的重要性。Powrózek 等人檢查了 NSCLC 患者 CTC 中的 SHOX2 基因甲基化，發(fā)現(xiàn) SHOX2 甲基化可以作為 NSCLC 預(yù)后和診斷的無創(chuàng)生物標(biāo)志物。這表明 CTC 中的甲基化分析可能用于臨床目的。已在癌癥患者的 CTC 中檢測到異常的 DNA 甲基化譜，這些模式已顯示出作為診斷或預(yù)后生物標(biāo)志物的前景。例如，Wong 等人的研究檢查了肺癌患者 CTC 的 DNA 甲基化模式，發(fā)現(xiàn)患者生存率與特定基因的甲基化水平之間存在相關(guān)性，HOXA9 和 LMX1A 基因的高甲基化水平與較差的總生存期相關(guān)，而 IGFBP3 基因的高甲基化水平與較好的總生存期相關(guān)。Wu 等人的另一項研究調(diào)查了肺腺癌患者 CTC 的 DNA 甲基化模式，并確定了與轉(zhuǎn)移相關(guān)的差異甲基化基因，GABRB2、CLDN3 和 SFRP1 的甲基化水平在有轉(zhuǎn)移和無轉(zhuǎn)移患者的 CTC 之間存在顯著差異。

CTC 的 DNA 甲基化在肺癌中的應(yīng)用

CTC 臨床應(yīng)用研究進(jìn)展

目前根除轉(zhuǎn)移的方法與用于原發(fā)性腫瘤的方法相同：專注于增殖和腫瘤發(fā)生，而不是直接解決轉(zhuǎn)移級聯(lián)反應(yīng)。如果已經(jīng)發(fā)生播散，則原發(fā)性腫瘤的手術(shù)干預(yù)或全身治療并不總是能根除轉(zhuǎn)移源。大多數(shù)抗癌藥物在轉(zhuǎn)移情況下進(jìn)行初步評估，然后重新用于輔助治療以阻止轉(zhuǎn)移擴(kuò)散。專門針對轉(zhuǎn)移的藥物的稀缺性，是許多臨床前研究和對未來臨床試驗框架正面臨的挑戰(zhàn)。從理論上講，針對轉(zhuǎn)移過程中不同點的 CTC 的療法可以阻止轉(zhuǎn)移性癌癥的進(jìn)展，因為 CTC 是轉(zhuǎn)移性癌癥的原因，并且可能來自腫瘤內(nèi)的不同亞群。

CTC 存在于所有主要癌癥類型的外周血中，其對結(jié)直腸、乳腺癌、前列腺以及小細(xì)胞和非小細(xì)胞肺惡性腫瘤預(yù)后的意義已得到驗證。當(dāng)患者首次被診斷出患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌時，開始治療前較高的 CTC 計數(shù)是較短的無病生存期和總生存期的預(yù)測指標(biāo)。對于結(jié)直腸癌和前列腺癌患者，治療前 CTC 計數(shù)與臨床預(yù)后之間也有研究報道其負(fù)相關(guān)關(guān)系。許多研究表明，與基線 CTC 水平相比，治療后 CTC 計數(shù)的波動提供了更可靠的預(yù)后見解。治療后 CTC 的持續(xù)存在與較差的預(yù)測相關(guān)。在接受治療的患者中，除了單次 CTC 計數(shù)外，CTC 簇豐度的評估還顯著提高了預(yù)后價值。

CTC 計數(shù)可在疾病臨床表現(xiàn)前 7-9 周檢測到。這表明患者的 CTC 分析可有助于預(yù)測微小殘留病和后期復(fù)發(fā)的可能性，并可作為早期癌癥診斷的工具。由于無創(chuàng)、高度可重復(fù)性和敏感性，循環(huán)腫瘤 DNA 甲基化的檢測已成為治療后動態(tài)監(jiān)測腫瘤反應(yīng)的關(guān)鍵方法。通過動態(tài)監(jiān)測循環(huán)腫瘤 DNA 甲基化，可以進(jìn)行早期腫瘤復(fù)發(fā)檢測，這有助于臨床決策。

靶向CTC 甲基化腫瘤治療研究進(jìn)展

循環(huán)腫瘤 DNA 提供的腫瘤信息有助于指導(dǎo)后續(xù)的靶向治療選擇。目前的研究主要集中在循環(huán)腫瘤 DNA 中的突變信息，詳細(xì)的基因突變分析可以闡明癌癥分子圖譜，從而有可能帶來更合適的治療方案。而關(guān)于使用循環(huán)腫瘤 DNA 甲基化進(jìn)行治療靶點選擇的研究很少。這種差異是由于癌癥患者循環(huán)腫瘤 DNA甲基化狀態(tài)變化是腫瘤反應(yīng)而不是腫瘤原因。

令人振奮的是，使用 DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑時，胰腺癌、乳腺癌和膀胱癌在內(nèi)的癌癥可能會受益于 DNA 甲基化靶向治療。有研究展示了CTC 中的 DNA 甲基化模式具有治療意義。例如，Chen 等人的一項研究表明，用一種叫做地西他濱的 DNA 去甲基化劑治療，通過逆轉(zhuǎn)肺癌患者細(xì)胞中異常的 DNA 甲基化模式，減少了這些細(xì)胞的 CTC 轉(zhuǎn)移。CTC 的 DNA 甲基化譜已顯示出在肺癌診斷、預(yù)后和治療方面的巨大潛力。

總結(jié)

CTC 是從原發(fā)腫瘤分離并進(jìn)入淋巴或循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細(xì)胞。這使得腫瘤細(xì)胞能夠擴(kuò)散到全身并導(dǎo)致新腫瘤的形成?；颊哐褐械?CTC 數(shù)量與疾病的進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的機(jī)會相關(guān)，甚至在通過常規(guī)方法識別腫瘤之前，患者的血液中就已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了 CTC，這提供了證據(jù)表明它們可能是腫瘤早期識別和監(jiān)測的寶貴工具。

DNA 甲基化是甲基添加到 DNA 的胞嘧啶殘基上，是調(diào)節(jié)某些基因表達(dá)所必需的。許多癌癥類型，包括肺癌，都與疾病發(fā)作和進(jìn)展時的異常 DNA 甲基化模式有關(guān)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn) DNA 甲基化在CTC 的免疫監(jiān)視和轉(zhuǎn)移中都起作用。免疫系統(tǒng)識別和清除癌細(xì)胞的方法稱為免疫監(jiān)視。然而，通過 DNA 甲基化，CTC 可以抑制免疫相關(guān)基因的表達(dá)，使它們能夠逃避免疫系統(tǒng)并持續(xù)存在于血液中。例如，已發(fā)現(xiàn)一些 CTC 具有參與抗原加工和呈遞的基因的 DNA 高甲基化，這可能有助于它們逃避免疫系統(tǒng)的識別和消除。此外，DNA 甲基化也參與 CTC 的轉(zhuǎn)移。例如，EMT 過程對癌細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移至關(guān)重要，它與參與細(xì)胞粘附和遷移的基因 Ecadherin的 DNA高甲基化有關(guān)。此外，已經(jīng)發(fā)現(xiàn) CTC 的轉(zhuǎn)移潛力受 DNA 修復(fù)和細(xì)胞周期調(diào)控相關(guān)基因低甲基化的影響。

這篇綜述概括了在癌癥背景下圍繞 CTC 生成的障礙，以及表觀遺傳學(xué)修飾對 CTC 在 EMT、免疫監(jiān)視、集群形成和定植方面的影響。CTC 中 DNA 甲基化導(dǎo)致的表觀遺傳修飾可能是解開肺癌轉(zhuǎn)移潛在機(jī)制的關(guān)鍵，并在肺癌診斷、預(yù)后和治療領(lǐng)域具有重要前景。